生物药物的分离纯化和提取方式课件.ppt

1、生物药物的分离纯化和提取方式生物药物的分离纯化和提取方式主要讲授内容 1.生物药物原料的选择、预处理与保存方法生物药物原料的选择、预处理与保存方法 2.生物药物的提取生物药物的提取 3.蛋白质类药物的分离纯化方法蛋白质类药物的分离纯化方法 4.核酸类药物的分离纯化方法核酸类药物的分离纯化方法 5.糖类药物的分离纯化方法糖类药物的分离纯化方法 6.脂类药物的分离纯化方法脂类药物的分离纯化方法 7.氨基酸类药物的分离纯化方法氨基酸类药物的分离纯化方法1.1 生物药物原料的选择生物药物原料的选择 生物药物生产原料的选择原则主要是：(1)有效成分含量高，原料新鲜有效成分含量高，原料新鲜；(2)原料来源

2、原料来源丰富，易得，原料产地较近丰富，易得，原料产地较近；(3)原料中杂原料中杂质含量少质含量少；(4)原料成本低等原料成本低等。但是，同时具备这4种有利因素的原料不多，生产研究者可酌情选择，但第一条是最重要的。原料的选择还要注意如下事项：植物原料原料的选择还要注意如下事项：植物原料要注意要注意植物生长的季节性植物生长的季节性，选择最佳采集，选择最佳采集时间；微生物原料要注意时间；微生物原料要注意微生物生长的对微生物生长的对数期长短数期长短；动物原料有的要注意动物的；动物原料有的要注意动物的类类别别、年龄年龄与与性别性别。也应注意原料的也应注意原料的采集地采集地和和批次批次。1.2 原料的预处

3、理与保存原料的预处理与保存 动物原料动物原料采集后要立即处理，去除结缔组采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；植物植物原料确定后原料确定后，要择时采集并就地除去没有，要择时采集并就地除去没有用的部分，将有用部分保鲜处理；用的部分，将有用部分保鲜处理；收集微收集微生物原料生物原料时时，要及时将菌体细胞与培养液，要及时将菌体细胞与培养液分开，进行保鲜处理。分开，进行保鲜处理。原料的保存方法主要有：原料的保存方法主要有：冷冻法冷冻法。该。该方法适用于所有生物原料。常用方法适用于所有生物原料。常用-40速速冻。冻。有机溶剂脱水法有机溶剂脱水法。常用

4、的有机溶。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。料，如脑垂体等。防腐剂保鲜防腐剂保鲜。常用。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。如发酵液、提取液等。2.生物药物的提取生物药物的提取 (1)生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎 (2)生物组织细胞破碎后立即进行提取生物组织细胞破碎后立即进行提取生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎 生物药物大部分存在于生物药物大部分存在于生物组织或细胞生物组织或细胞中，中，

5、要提高提取率，对生物组织与细胞的破碎要提高提取率，对生物组织与细胞的破碎过程是非常重要的过程是非常重要的。常用的破碎方法有5种：A.磨切法磨切法，该法属于机械破碎方法，使用该法属于机械破碎方法，使用的设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、的设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。匀质机、球磨机、乳钵等。B.压力法压力法，这类方法有加压与减压两种，这类方法有加压与减压两种，常用的常用的法兰西压釜法兰西压釜使用效果良好。使用效果良好。C.反复冻融法反复冻融法，该方法设备简便，活性保持好，但用时较长。D.超声波振荡破碎法超声波振荡破碎法，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失

6、。E.自溶法或酶解法自溶法或酶解法，用得较少。生物组织活性物质的提取要在细胞破碎后生物组织活性物质的提取要在细胞破碎后立即进行。立即进行。提取过程中提取过程中（1）要根据活性物质的性质，选择提取要根据活性物质的性质，选择提取试剂。试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂盐溶液、乙醇、其他有机溶剂(如氯仿、丙如氯仿、丙酮等酮等)。（2）考虑提取溶剂的用量（料液比）及考虑提取溶剂的用量（料液比）及提取次数、提取时间。提取次数、提取时间。（3）注意提取的温度、注意提取的温度、pH、变性剂等、变性剂等因素。因素。这样才可以保证活性物质提取充这样才可以

7、保证活性物质提取充分而且不变性。分而且不变性。3.蛋白质类药物的分离纯化方法蛋白质类药物的分离纯化方法 蛋白质类药物主要包括蛋白质、多肽和酶蛋白质类药物主要包括蛋白质、多肽和酶类等药物。它们的分离纯化方法有：类等药物。它们的分离纯化方法有：(1)沉淀法沉淀法(2)按按分子大小分离分子大小分离的方法的方法(3)按按分子所带电荷分子所带电荷进行分离的方法进行分离的方法(4)亲和层析法亲和层析法(1)沉淀法沉淀法 蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。该蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。该法的原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而法的原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有沉淀蛋白质。常用的有盐析

8、法盐析法、有机溶剂有机溶剂沉淀法沉淀法、等电点沉淀法等电点沉淀法、与靶物质结合沉与靶物质结合沉淀法淀法(如抗体一抗原如抗体一抗原)等。等。(2)按分子大小分离的方法按分子大小分离的方法 这类方法有这类方法有超滤法超滤法和和透析法透析法(即膜分离方法即膜分离方法)、凝胶层析法凝胶层析法、超速离心法超速离心法等。其中膜分离等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。脱盐。(3)按分子所带电荷进行分离的方法按分子所带电荷进行分离的方法 氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有等电点，在离开等电点的质。它们具有

9、等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为点为7.0，当溶液，当溶液pH为为4.0时，分子则带有时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。进行分离是极其有效的方法。利用蛋白质带电性质行分离的方法有：利用蛋白质带电性质行分离的方法有：离子交换柱层析法离子交换柱层析法；电泳法电泳法；等电聚焦法等电聚焦法。（4）亲和层析法）亲和层析法 大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如如酶与底物酶与底物(或抑制剂或抑制剂)、抗原与抗体抗原与抗体

10、、激素激素与受体与受体等，它们之间有特异的亲合作用，等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析。亲和层析分离专一性强亲和层析分离专一性强，操作，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。亲和层析法主要包括：亲和层析法主要包括：疏水反应层析、金疏水反应层析、金属螯合层析、免疫亲和层析、共价亲和层属螯合层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、固定化染料亲和层析、特殊基团亲和析、固定化染料亲和层析、特殊基团亲和层析等。层析等。亲和层析技术大量应用于蛋白质亲和层析技术大量应用于蛋白质分离和纯化

11、。分离和纯化。4.核酸类药物的分离纯化方法核酸类药物的分离纯化方法 核酸类药物生产方法主要有核酸类药物生产方法主要有提取法提取法和和发酵发酵法法。提取法提取法生产生产DNA和和RNA的主要技术是，先的主要技术是，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离蛋白质，然后分离RNA与与DNA。发酵法发酵法主要用于生产单核苷酸。主要用于生产单核苷酸。5糖类药物的分离纯化方法糖类药物的分离纯化方法 由于各种糖类药物的性质和原料来源不同，由于各种糖类药物的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍介绍多糖

12、多糖和和粘多糖粘多糖的一般分离纯化方法。的一般分离纯化方法。提取方法提取方法 非降解法非降解法：适用于从含一种粘多糖的动物：适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水水或或盐盐溶液。溶液。降解法：降解法：适用于从组织中提取结合比较牢适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。例如从软骨中分离提取硫酸固的粘多糖。例如从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解，又如用软骨素，就是用碱处理进行降解，又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。(2)分离方法分离方法 常用的分离纯化多糖的方法是常用的分离纯化多糖的方法

13、是乙醇沉淀法乙醇沉淀法和和离子交换层析法离子交换层析法。乙醇沉淀法乙醇沉淀法是从提取液中沉淀多糖的最简易是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于方法，也适用于分级分离分级分离。用。用45倍体积的倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。淀。季铵化合物季铵化合物也可用于沉淀粘多糖也可用于沉淀粘多糖,其原理是其原理是粘多糖的聚阴离子粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵铵(CTA)等。等。离子交换层析法：离子交换层析法：粘多糖的聚阴离子能够粘多糖的聚阴

14、离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如Dowex-I-X2离子交换树脂、离子交换树脂、DEAE-离子离子交换纤维素交换纤维素*等。洗脱可用等。洗脱可用NaCl溶液进行溶液进行梯度洗脱。梯度洗脱。注意从粗多糖中除去蛋白常用的方法有：注意从粗多糖中除去蛋白常用的方法有：Sevag法法、三氯乙酸法三氯乙酸法和和蛋白酶解法蛋白酶解法。*二乙氨基乙基纤维素二乙氨基乙基纤维素6.脂类药物的分离纯化方法脂类药物的分离纯化方法 (1)提取方法提取方法 脂类自然状态下是以结合脂类自然状态下是以结合形式存在的。形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子非极性脂是与其他脂质分子或蛋白

15、质分子的疏水区相结合的或蛋白质分子的疏水区相结合的。因此，。因此，提取脂质药物就是提取脂质药物就是要选择适当的溶剂来破要选择适当的溶剂来破坏这种结合键坏这种结合键，将脂质溶解出来。常用的，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。此外还有氯仿、甲醇、水等。(2)纯化方法纯化方法 沉淀法：沉淀法：由于不同脂质在丙酮中溶解度由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。不同，故常用它进行沉淀。吸附层析法：吸附层析法：常用吸附剂有硅胶、氧化常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子键力等把各铝等。它是通过极性和离子

16、键力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。一般是种化合物结合到固体吸附剂上。一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性组分先流出，极性组分后流出。极性组分先流出，极性组分后流出。离子交换层析法：离子交换层析法：脂质分子的存在有脂质分子的存在有非非解离解离和和酸式解离酸式解离两种状态。根据它们在两种状态。根据它们在一定一定pH条件下的解离情况，选择适当的条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂可将它们提纯。如离子交换剂可将它们提纯。如TEAE-纤纤维素维素*对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。三乙氨基乙基纤维素三乙氨基乙基纤维素7.氨基酸

17、类药物的分离纯化方法氨基酸类药物的分离纯化方法 氨基酸的生产方法：氨基酸的生产方法：蛋白质水解法蛋白质水解法 发酵法发酵法 化学合成与酶促合成法化学合成与酶促合成法 蛋白质水解法蛋白质水解法：水解法有：水解法有酸酸水解、水解、碱碱水水解和解和酶酶水解三种。用盐酸水解为常用方水解三种。用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是部是L-型氨基酸，缺点是色氨酸全部被型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。碱水解法破坏，丝氨酸等部分被破坏。碱水解法易产生消旋作用，较少应用。酶水解法易产生消旋作用，较少应用。酶水解法水解不够完全。水解不够完全

18、。发酵法：发酵法：发酵法主要是选育特异产生某发酵法主要是选育特异产生某种氨基酸的菌株，经过发酵后，从培养种氨基酸的菌株，经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。液中提纯氨基酸。化学合成与酶促合成法化学合成与酶促合成法：化学合成法化学合成法一般一般得到的是得到的是D/L-型氨基酸型氨基酸，需要对需要对这些异构这些异构体拆分；体拆分；酶促合成法酶促合成法也是酶工程在医药工也是酶工程在医药工业上应用的一个内容，优点是技术工艺简业上应用的一个内容，优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。单，转化率高，副产物少和易提纯等。氨基酸的分离方法：氨基酸的分离方法：沉淀法沉淀法 吸附法吸附法 离子交换法离子

19、交换法 沉淀法：沉淀法：根据形成沉淀的原理不同分为根据形成沉淀的原理不同分为两种：一种是依据不同两种：一种是依据不同氨基酸在水中氨基酸在水中或或其他溶剂中的溶解度差异其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。进行沉淀分离。另一是用另一是用特殊试剂沉淀特殊试剂沉淀某种氨基酸，如某种氨基酸，如用用邻二甲苯邻二甲苯-4-磺酸与亮氨酸磺酸与亮氨酸形成不溶性形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来。出来。吸附法：吸附法：这是利用吸附剂根据氨基酸吸这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就

20、是利丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。用活性炭对其吸附的原理。离子交换法：离子交换法：氨基酸是两性电解质，在氨基酸是两性电解质，在一定一定pH条件下，不同氨基酸带电性质及条件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的，因此在离子交换解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要用要用pH梯度洗脱。梯度洗脱。主要是蛋白质分离（1）固相化金属亲和层析）固相化金属亲和层析(IMAC)IMAC是近十年来发展起来的一种亲和层析是近十年来发展起来的一种亲和层

21、析技术。其原理是利用蛋白质分子中的咪唑基技术。其原理是利用蛋白质分子中的咪唑基和巯基与一些金属元素和巯基与一些金属元素(Cu2+、Zn2+等等)配位配位结合，使蛋白质得到分离纯化。该法比传统结合，使蛋白质得到分离纯化。该法比传统的的凝胶过滤一离子交换法凝胶过滤一离子交换法简单简单、省时，适于、省时，适于实验室规模纯化。实验室规模纯化。（2）超扩散层析）超扩散层析 这种层析所用介质是这种层析所用介质是Biosepra公司生产的公司生产的Hyper-D。该层析介质的颗粒由。该层析介质的颗粒由刚性框架刚性框架结结构中填充构中填充官能化的软凝胶组成官能化的软凝胶组成。它兼备。它兼备了软凝胶的了软凝胶的

22、高上样量高上样量和普通刚性介质的和普通刚性介质的高高流速流速。这种结构可使层析操作在高流速下进行而这种结构可使层析操作在高流速下进行而保证高上样量和高分辨率，并且无反压产保证高上样量和高分辨率，并且无反压产生生。Hyper-D具有化学隋性具有化学隋性。可用酸碱进可用酸碱进行再生和杀菌行再生和杀菌，可用于纯化免疫球蛋白、，可用于纯化免疫球蛋白、白蛋白、激素、酶、细胞培养或发酵产生白蛋白、激素、酶、细胞培养或发酵产生的蛋白质。适用于实验室小试直至工业化的蛋白质。适用于实验室小试直至工业化大生产。大生产。(3)灌注层析灌注层析 1987年由年由Regnier等人发明的等人发明的灌注填料技灌注填料技术

23、术使快速分离纯化生物大分子得以实现。使快速分离纯化生物大分子得以实现。1989年与之相配套的灌注系统年与之相配套的灌注系统(BioCAD workstation)问世，给微生物制药领域的问世，给微生物制药领域的科学家提供了强有力的工具，给生物制药科学家提供了强有力的工具，给生物制药业带来了突破性的进展。业带来了突破性的进展。它所采用的它所采用的POROUS介质以苯乙烯基二乙介质以苯乙烯基二乙烯基苯的聚合物构成，为双模式孔结构，烯基苯的聚合物构成，为双模式孔结构，在介质上有在介质上有80150nm的的扩散孔扩散孔和和600800nm的的贯穿孔贯穿孔。它允许液体对流到分离。它允许液体对流到分离介质

24、的内表面，从而大大加快了分离速度。介质的内表面，从而大大加快了分离速度。灌注层析系统可有效、快速地纯化各种蛋灌注层析系统可有效、快速地纯化各种蛋白质、多肽、核酸等生物大分子。白质、多肽、核酸等生物大分子。它比传统柱快它比传统柱快l0100倍，分析一个样品只倍，分析一个样品只需要需要0.53min。日本制药公司。日本制药公司Otsuka使使用博大生物技术公司的用博大生物技术公司的POROS-50介质和介质和大生产规模系统大生产规模系统(autopilot)生产单克隆抗体，生产单克隆抗体，从从320L样品中纯化出样品中纯化出13g抗体只花了抗体只花了80min，收率收率95。(4)其他快速分离纯化

25、系统其他快速分离纯化系统 streamline扩张柱床吸附技术扩张柱床吸附技术：已广泛：已广泛应用于应用于Ecoli如包涵体、胞内、细胞膜、如包涵体、胞内、细胞膜、胞外分泌和酵母、动物、杂交瘤细胞、昆胞外分泌和酵母、动物、杂交瘤细胞、昆虫细胞等表达的重组蛋白的纯化，也被用虫细胞等表达的重组蛋白的纯化，也被用于单抗及天然酶的纯化。于单抗及天然酶的纯化。AKTA explorer快速纯化开拓系统快速纯化开拓系统：能能高效地纯化各种蛋白质、肽、寡核苷酸和高效地纯化各种蛋白质、肽、寡核苷酸和核酸等核酸等。系统有预编程序，放好样品，按。系统有预编程序，放好样品，按启动按钮，系统就会完成余下的工作，如启动

26、按钮，系统就会完成余下的工作，如自动取样、制备适当自动取样、制备适当pH缓冲液、选择适当缓冲液、选择适当的柱、再现显示分离流程和检测状况、收的柱、再现显示分离流程和检测状况、收集峰、自动进行数据处理并打印纯化报告。集峰、自动进行数据处理并打印纯化报告。设置的预编程序可从分析到小试摸索至中设置的预编程序可从分析到小试摸索至中试生产。试生产。快速蛋白液相色谱快速蛋白液相色谱(FPLC)：已用于蛋白已用于蛋白质、多肽、核酸等质、多肽、核酸等400余种生物分子的纯化。余种生物分子的纯化。利用利用FPLC发展的纯化流程可直接放大到中发展的纯化流程可直接放大到中试或大规模生产。试或大规模生产。biological system：它视为高分辨生：它视为高分辨生物分子纯化而设计的层析系统。其软件物分子纯化而设计的层析系统。其软件充分利用了微软视窗操作系统的优良图充分利用了微软视窗操作系统的优良图形界面，加速了开发和优化生物分子分形界面，加速了开发和优化生物分子分离流程的方案。离流程的方案。谢谢！